Sviluppo di CRISPR come strategia antivirale per combattere SARS-CoV-2 e influenza

Riassunto e traduzione dell’articolo: Abbott TR, Dhamdhere G, Liu Y, et al. Development of CRISPR as an Antiviral Strategy to Combat SARS-CoV-2 and Influenza. Cell. 2020;181(4):865-876.e12.

Riassunto e traduzione a cura di: Alessio Silva; Revisionato: Marianna Coppola

PAC-MAN (CRISPR profilattica antivirale in cellule umane), una strategia basata su Cas13, può degradare efficacemente l’RNA di sequence di SARS-CoV-2 e del virus dell’influenza A in cellule epiteliali polmonari umane. Gli autori hanno progettato e selezionato CRISPR RNAs complementari a regioni virali conservate, identificando 6 crRNA in grado di colpire oltre il 90% di tutti i coronavirus. Pertanto, PAC-MAN potrebbe diventare una potenziale strategia di inibizione pan-coronavirale.

Gli autori propongono un approccio antivirale profilattico e personalizzabile basato sull’utilizzo di VI-D CRISPR-Cas13d tipo 2 (PAC-MAN), in grado di degradare simultaneamente genomi virali intracellulari ed i risultanti RNA subgenomici e mRNA in cellule umane, tra cui SARS-CoV-2 e influenza A virus (IAV), in modo da fornire un’ampia protezione virale.

Non avendo a disposizione virioni di SARS-CoV-2, gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando frammenti virali e ceppi di H1N1 come verifica sperimentale, usando come modello cellule A549 epiteliali polmonari umane.

Tramite approcci bioinformatici, sono stati progettati, analizzati e selezionati 40 crRNA complementari a regioni altamente conservate tra le tante sequenze genomiche di SARS-CoV-2 sequenziate. In particolare, 20 crRNA hanno come target il gene che codifica per la RNA-polimerasi RNA-dipendente (RdRP), mentre gli altri 20 quello del nucleocapside (N).

Per convalidare l’attività di Cas13d, gli autori hanno sviluppato una linea cellulare A549 che esprimesse stabilmente l’enzima. Quindi, hanno trasfettato o trasdotto uno dei due reporter che esprimono frammenti sintetizzati di SARS-CoV-2 fusi a GFP (SARS-CoV-2-RdRP-F1 e SARS-CoV-2-RdRP-N-F2) insieme a pool di 4 crRNA destinati al gene RdRP o N.

Sono stati testati dieci gruppi (G1-G10) di crRNAs ed i risultati sono stati analizzati 24 ore dopo tramite citometria a flusso e qPCR, rivelando che G4 complementare al frammento RdRP di F1 era particolarmente efficace ed in grado di reprimere GFP. Una forte riduzione dell’espressione di GFP è stata provocata anche da G5 e G6, con target le porzioni RdRP e N di F2. Risultati simili sono stati ottenuti con l’analisi qPCR. Inoltre, un alto livello di concentrazione di crRNA, ma non di Cas13d, è in grado di aumentare l’efficacia di taglio.

Successivamente, gli autori hanno testato Cas13d PAC-MAN sul ceppo H1N1 di IAV. L’analisi bioinformatica ha identificato 6 crRNA destinati a regioni altamente conservate per ciascuno degli 8 segmenti di RNA del genoma di IAV. Hanno quindi trasfettato quei pool nelle cellule A549-Cas13d poi infettate in condizioni stringenti con un ceppo IAV H1N1 marcato con NeON. Risultati ottimali sono stati ottenuti con il pool mirato ai segmenti 6 e 4, che codificano rispettivamente per le proteine ​​neuraminidasi ed emoagglutinina. Inoltre, la replicazione di IAV è stata fortemente inibita a cariche virali inferiori, suggerendo un’applicazione più efficace di Cas13d nel prevenire l’infezione.

Infine, sono stati analizzati 91’600 ceppi di IAV sequenziati, trovando che 81 crRNA sono in grado di riconoscerli tutti e che un gruppo minimo di 6 crRNA ne copre il 92%, suggerendo un potenziale approccio inibitorio pan-IAV. La stessa analisi è stata eseguita su tutti i 3’051 genomi di coronavirus noti, scoprendo 6 crRNA con target il 91% dei coronavirus sequenziati senza mismatch e 22 crRNA in grado di colpirli tutti. Ciò espande le applicazioni dei sistemi CRISPR-Cas13 al di là della diagnostica, con PAC-MAN potenzialmente in grado di colpire non solo i virus che circolano nell’uomo ma anche quelli presenti nei reservoire animali.

Prospettive future:

  • Infezione di modelli in vitro con virioni di SARS-CoV-2;
  • PAC-MAN inibisce le sequenze virali in vitro ma è necessario validarne l’efficacia, la specificità, l’immunogenicità e la farmacodinamica in vivo attraverso modelli preclinici.

Limitazioni:

  • I crRNA devono essere validati per effetti off-target;
  • PAC-MAN deve essere espresso in una determinata percentuale di cellule per essere efficace;
  • I livelli di Cas13d/crRNA in vivo devono essere ottimizzati;
  • La struttura secondaria del genoma virale e/o i rivestimenti proteici possono ridurre l’efficacia dell’inibizione.

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