MINIREVIEW: RNA Polimerasi RNA-dipendente di SARS-CoV-2: struttura e target farmacologico

Analisi della letteratura e traduzione di: Livia Tepshi, Giulia Poggi; Revisionato: Valeria Montis

La risoluzione delle strutture proteiche di SARS-CoV-2 è essenziale per sviluppare un intervento farmacologico appropriato e specifico per combattere l’attuale pandemia di CoViD-19. L’RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp, chiamata anche Nsp12) è il componente fondamentale del meccanismo di replicazione/trascrizione dei Coronavirus e sembra essere il bersaglio primario per il farmaco antivirale Remdesivir. In particolare, la struttura risolta di RdRp può anche servire da modello per progettare nuovi composti attivi verso Nsp12.

CoViD-19 è una malattia infettiva causata dal Coronavirus 2 da sindrome respiratoria acuta grave, abbreviato SARS-CoV-2. Rispetto a SARS-CoV e MERS-CoV, SARS-CoV-2 è meno letale, ma sicuramente più contagioso e si trasmette molto rapidamente da uomo a uomo [1]. Una componente fondamentale nel ciclo di replicazione e trascrizione di SARS-CoV-2 è la proteina non-strutturale 12 (Nsp12). Nsp12 funge da subunità catalitica della RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) ed esercita la sua funzione con l’ausilio di due co-fattori principali: la proteina non strutturale 7 (Nsp7) e la proteina non-strutturale 8 (Nsp8) (Fig. 1). Le RdRp sono in effetti proteine ​​multi-dominio in grado di catalizzare la formazione dipendente da modelli di RNA di legami fosfodiesterici tra ribonucleotidi. Nsp12 è pertanto considerato uno dei bersagli principali per interventi farmacologici contro COVID-19, quali l’analogo nucleosidico antivirale Remdesivir [2].

Figure 1, adapted from Huang et al. 2020
Figure 1, adapted from Huang et al. 2020

La struttura della RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp) di SARS-CoV-2

Tramite microscopia crioelettronica, Gao et al. e Hillen et al. hanno recentemente risolto la struttura della RdRp, rispettivamente nello stato inattivo e attivo (risoluzione di 2.9-Å) [3, 4]. Le principali informazioni strutturali di RdRp sono riportate nella tabella sottostante:

Subunitá Abbreviazione Tipologia Informazioni strutturali
Proteina non-strutturale 12 Nsp12 catalitica N-terminale con struttura tipica di un nucleotidil transferasi associata al RdRP coronavirus (NiRAN).
      Dominio di interfaccia che connette il dominio N-terminale al dominio C-terminale.
      Il C-terminale é  un dominio polimerico “a mano destra”: sottodominio “a dito” (residui L366-A581 e K621-G679);sottodominio “a palmo” (residui T582-P620 e T680-Q815);sottodominio “a pollice” (residui H816-E920);
      il sito attivo é localizzato nel dominio “a palmo”;Motivo A (611-TPHLMGWDYPKCDRAM-626) nel dominio “a palmo” include il classico residuo D618 normalmente coinvolto in legami cationici bivalenti. Questa tipologia di legame è conservata nella maggior parte delle polimerasi virali, quali HCV ns5b (residuo D220) and poliovirus (PV) 3Dpol (residuo D233);Motivo C contiene i residui catalitici;
      Lega il primo giro di RNA: motivo C lega la molecola di RNA al 3′ i motivi F and G si occupano di posizionare correttamente il templato di RNA
      Il sito di legame del nucleoside trifosfato (NTP) é conservato (confronto con Norovirus RdRp).
Proteina non-strutturale 8 Nsp8 accessoria/co-fattore Due Nsp8 legano i domini “a dito” e “a pollice” della subunitá catalitica Nsp12.
      Le due Nsp8 si distinguono tra loro per come si legano a Nsp7 e Nsp12
      Flessibile e in grado di adattarsi strutturalmente alla molecola di RNA in entrata.
      Rispetto alla Nsp8 di altri virus, la Nsp8 di SARS-CoV-2 presenta 13 residui amminoacidici aggiuntivi al N-terminale, probabilmente implicati nel prevenire una dissociazione prematura della molecola di RNA durante la replicazione. Si noti che una sostituzione di una lisina con una alanina in posizione 58 risulterebbe letale per il virus.
      Le regioni N-terminali affiancano la molecola di RNA in uscita dalla subunitá catalitica Nsp12.
      Fondamentale per l’estensione del RNA virale.
      In presenza di RNA virale, si puó osservare un’estensione nella struttura di Nsp8.
Proteina non-strutturale 7 Nsp7 accessoria/co-fattore Lega il dominio “a pollice” di Nsp12
      Fondamentale per l’estensione del RNA virale.
      La struttura del complesso Nsp7/Nsp8 è altamente conservata e molto simile a quella di SARS-CoV.

Interventi farmacologici mirati a RdRp Attualmente, uno degli inibitori più studiati di RdRp nel contesto del trattamento della CoViD-19 è il Remdesivir. Il Remdesivir (GS-5734, Gilead), inizialmente sviluppato per prevenire la replicazione del virus Ebola (EBOV) [6], è un profarmaco analogo nucleosidico antivirale indicato come inibitore della proliferazione di SARS-CoV-2. Data l’analogia strutturale con il nucleoside adenosina, il Remdesivir può essere incorporato dalla RdRp e interrompere la replicazione della molecola di RNA virale. È importante sottolineare che il Remdesivir è in grado di distinguere efficacemente l’RNA polimerasi virale dalla RNA polimerasi mitocondriale umana (pannello da Owen et al. e [10]) [6].

L’esatto meccanismo di Remdesivir non è stato confermato. Tuttavia, nelle cellule di insetti che esprimono i complessi RdRp di SARS-CoV e SARS-CoV-2, la forma trifosfato di Remdesivir (RDV-TP) sembrerebbe agire come terminatore di catena non obbligato. RDV-TP viene infatti incorporato nel complesso RdRP e interrompe la sintesi di RNA dopo qualche ulteriore aggiunta di ribonucleotidi endogeni [7]. È stato suggerito che questi nucleotidi aggiuntivi potrebbero essere fondamentali per proteggere dall’attività di “correzione di bozze” e dall’attività esonucleasica mediata da Nsp14 [7].

Yin et al. [8] hanno fornito ulteriori dati strutturali a supporto del meccanismo di azione proposto per Remdesivir. Tramite microscopia crioelettronica, hanno risolto la struttura di Nsp12/Nsp7/Nsp8 legata all’RNA e alla forma trifosfato del Remdesivir (risoluzione di 2,5 Å). Gli autori hanno confermato che la molecola di RNA interagisce direttamente con Nsp12 e che non forma legami diretti con Nsp7 e Nsp8, sebbene questi co-fattori siano fondamentali per il legame dell’RNA alla RdRp. In aggiunta, hanno rilevato la presenza di un singolo monofosfato di Remdesivir (RMP), seguito da ulteriori ribonucleotidi, all’estremità 3′ del filamento di RNA, a supporto dell’ipotesi che che il Remdesivir agisca come un terminatore non obbligato della sintesi di RNA [8]. É importante tenere in considerazione  che i residui leganti l’RNA e i residui catalitici del sito attivo sono altamente conservati e, pertanto, costituiscono un potenziale bersaglio per un trattamento antivirale ad ampio spettro.

Oltre al Remdesivir, altri analoghi nucleosidici hanno mostrato attività inibitoria sulla replicazione SARS-CoV-2 in vitro. Tra questi si  includono Favipiravir, Ribavirin, Galidesivir ed EIDD-2801. In particolare, EIDD-2801 ha dimostrato di essere da 3 a 10 volte più potente del Remdesivir nel bloccare la replicazione di SARS-CoV-2. Potrebbe pertanto risultare un’alternativa farmacologica da testare e validare.

Analisi di docking molecolare e screening in silico hanno fornito ulteriori candidati con potenziale capacitá di legame al dominio catalitico di RdRp. Questi principi attivi comprendono composti naturali della medicina cinese, come le teaflavine,  e potrebbero agire come inibitori dell’attivitá di RdRp[9]. Sono tuttavia necessari ulteriori studi per valutare e validare l’efficacia di questi composti alternativi [9].

In conclusione, la risoluzione della struttura delle subunità RdRp ha fornito conoscenze fondamentali su nuovi potenziali target farmacologici per il trattamento dell’infezione da SARS-CoV-2. Oltre a rivolgersi ad altri candidati promettenti, come la proteasi principale (Mpro), indirizzare farmacologicamente domini altamente conservati in RdRp potrebbe contribuire allo sviluppo di trattamenti cocktail anti-coronavirus che potenzialmente possono essere usati come antivirali ad ampio spettro.

Bibliografia:

[1] Chan J.F.W. et al., A familial cluster of pneumonia associated with the 2019 Novel Coronavirus indicating person-to-person transmission: a study of a family cluster, Lancet, 24 January 2020.

[2] Wang M. et al., Remdesivir and Chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel Coronavirus (2019-nCoV) in vitro, Cell Res., March 2020.

[3] Gao Y. et al., Structure of the RNA-dependent RNA polymerase from COVID-19 virus, lScience, 10 April 2020.

[4] Hillen H.S. et al., Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase, lNature, 21 May 2020.

[5] Kirchdoerfer R. et al.,  Structure of the SARS-CoV Nsp12 Polymerase Bound to Nsp7 and Nsp8 co-factors, Nature Communication, 28 May 2019.

[6] Huang J. et al., Pharmacological Therapeutics Targeting RNA-Dependent RNA Polymerase, Proteinase and Spike Protein: From Mechanistic Studies to Clinical Trials for COVID-19, Journal of Clinical Medicine, 15 April 2020.

[7] Gordon C.J. et al., Remdesivir is a direct-acting antiviral that inhibits RNA-dependent RNA polymerase from severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 with high potency, lJBC, 13 April 2020.

[8] Yin W. et al., Structural basis for inhibition of the RNA-dependent RNA polymerase from SARS-CoV-2 by remdesivir, lScience, 01 May 2020.

[9] Lung J. et al., The potential chemical structure of anti‐SARS‐CoV‐2 RNA‐dependent RNA polymerase,lJournal of Medical Virology, 13 March 2020.

[10] Scudellari M., The sprint to solve coronavirus protein structures — and disarm them with drugs, Nature, 15 May 2020.

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Siamo un gruppo di medici, biologi, e ricercatori. Scriviamo in associazione con AIRIcerca in capacità privata (non rappresentiamo le rispettive istituzioni!) nel tentativo di aiutare i medici italiani che stanno affrontando l’epidemia Covid19. Controlliamo costantemente la letteratura scientifica e forniamo brevi riassunti in italiano peer-reviewed (troverete per ogni riassunto il nome di chi lo ha scritto e chi lo ha revisionato). Per agevolare la ricerca delle informazioni, assegnamo delle parole-chiave ad ogni riassunto. Speriamo in questo modo di fornire una versione concisa e in italiano di quanto di nuovo ha da offrire la letteratura scientifica sull’epidemia.

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