Una endoribonucleasi dei coronavirus colpisce la sequenza virale di poliuridine per eludere l’attivazione del sistema immunitario innato dell’ospite

Riassunto e traduzione dell’articolo: Matthew Hackbarta, Xufang Denga, and Susan C. Baker, Coronavirus endoribonuclease targets viral polyuridine sequences to evade activating host sensors, PNAS

Riassunto e traduzione a cura di: Valentina Casà; Revisionato: Claudia Foray

Articolo Originale Pubblicato il 7 Aprile 2020

Per evitare di essere riconosciuti dal sistema immunitario, i coronavirus (CoV) esprimono fattori che interferiscono con i sensori dell’immunità innata dell’ospite. Mediante una endoribonucleasi (EndoU), l’RNA virale poliuridinico a polarità negativa (PUN RNA) viene scisso, per impedirne il riconoscimento da parte del sensore dell’ospite MDA5 e ritardare così la risposta interferonica (IFN). EndoU è altamente conservata in tutti i CoV, quindi potrebbe essere un buon bersaglio per approcci terapeutici.

I CoV sono virus a RNA. Durante la replicazione del loro genoma, si generano filamenti a polarità negativa e RNA intermedi a doppio filamento (dsRNA). Questi possono essere riconosciuti dal recettore citoplasmatico dell’ospite MDA5, attivando una risposta interferonica di tipo I. E’ noto che l’azione di una endoribonucleasi (EndoU) virale limita il riconoscimento del dsRNA da parte del sistema immunitario dell’ospite.

Per studiare questo meccanismo, gli autori hanno preso in esame la proteina virale non strutturale 15 (nsp15) antagonista dell’IFN, una EndoU che scinde i residui uridinici dei dsRNA. Hanno infettato epatociti (la linea cellulare responsiva all’IFN AML12) e macrofagi (IFNAR-/- macrofagi derivati dal midollo osseo) con un CoV (MHV-A59) sia wild-type che con un mutante cataliticamente inattivo (EndoUmut), ed hanno fatto uso di un anticorpo anti-dsRNA (K1).

Con esperimenti di immunofluorescenza, seguiti da sequenziamento e analisi di qPCR di RNA virale immunoprecipitato con K1, hanno dimostrato che (i) l’attività di EndoU riduce l’accumulo di un epitopo riconosciuto da K1, (ii) l’anticorpo precipita RNA a polarità negativa e (iii) EndoU riduce l’accumulo di RNA di CoV a polarità negativa.

L’estremità 5′ dell’RNA a filamento negativo del CoV contiene code poliU. Poiché EndoU scinde i residui di uridina, l’RNA PUN è stato considerato il potenziale target di EndoU. Dopo aver sintetizzato il cDNA strand-specifico e utilizzando tecniche di Nested PCR e sequenziamento, è risultato che (i) in assenza di EndoU gli RNA PUN si accumulano e (ii) l’attività di EndoU riduce l’accumulo e la lunghezza delle catene poliU. Dal momento che EndoU è conservato tra i CoV, gli autori hanno dimostrato che l’attività di EndoU è conservata anche in altri ceppi virali, come il virus della diarrea suina alfa-CoV (PEDV).

Questi risultati indicano che gli RNA PUN vengono generati durante la replicazione di alfa- e beta-CoV. Dato che EndoU sopprime l’attivazione del recettore MDA5, si è valutato se il CoV PUN RNA agisse come pattern molecolare associato a patogeni (PAMP). La transfezione di epatociti AML12 con PUN RNA del CoV MHV risulta in un incremento della produzione di IFN che dipende dalla lunghezza della coda poliU. Inoltre, utilizzando un knockdown di MDA5 è risultato che il rilascio di IFN causato dall’infezione virale o dalla trasfezione di RNA PUN dipende da MDA5. Da ciò si conclude che il PUN RNA agisce come una PAMP virale MDA5-dipendente.

Eseguendo una serie di saggi di clivaggio in vitro, gli autori hanno dimostrato che EndoU può scindere i PAMP rappresentati dai PUN RNA e che i residui di uridina sono necessari per la sua attività. È importante notare che l’attività di EndoU sul PUN RNA smorza la risposta immunitaria causata dal rilascio di IFN. Infatti, la transfezione di cellule AML12 con RNA trattato con EndoU riduce la stimolazione da IFN.

Nel complesso, questo studio rivela che la EndoU dei CoV scinde le sequenze poliU degli RNA PUN per ritardarne il riconoscimento da parte dei sensori immunitari innati dell’ospite. Essendo un fattore di virulenza altamente conservato, EndoU rappresenta un potenziale bersaglio per le strategie antivirali e vaccinali.

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