Neutralizzazione del SARS coronavirus grazie ad un anticorpo monoclonale anti proteina S1 che ne blocca l’associazione con il recettore target

Riassunto e traduzione di: Jianhua Sui, Wenhui Li, Akikazu Murakami, Azaibi Tamin, Leslie J. Matthews, Swee Kee Wong, Michael J. Moore, Aimee St. Clair Tallarico, Mobolaji Olurinde, Hyeryun Choe, Larry J. Anderson, William J. Bellini, Michael Farzan, and Wayne A. Marasco, Potent neutralization of severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus by a human mAb to S1 protein that blocks receptor association, PNAS February 24, 2004 101 (8) 2536-2541.

Riassunto e traduzione a cura di: Sara Lucia Maria Lo Russo   Revisionato da: Stefania Principe

Articolo Originale Pubblicato il 24 Febbraio 2020

Sono stati identificati 8 frammenti variabili a catena singola (scFvs) contro il dominio S1 della proteina Spike del SARS coronavirus, uno di questi 8 frammenti inibisce efficacemente la formazione del sincizio tra le cellule che esprimono la proteina S e quelle che esprimono l’enzima di conversione dell’Angiotensina 2 (ACE2)

La proteina Spike dei coronavirus è una glicoproteina transmembrana formata da due domini funzionali all’estremità ammino (S1) e carbossi (S2) terminale. E’ stato recentemente dimostrato che il legame tra il dominio S1 e l’enzima di conversione dell’Angiotensina 2 (ACE2) espresso dalla cellula ospite è responsabile dell’ingresso del SARS CoV all’interno della cellula. Basandoci su  questo dato, abbiamo utilizzato la proteina S1 per generare un anticorpo monoclonale umano 80R anti SARS CoV che riuscisse a bloccare il legame tra S1 e ACE.

Metodi: Tramite l’utilizzo di vettori plasmidici sono state ottenute delle proteine S ricombinanti (S1-Ig dai residui 12-672, 12-327 fusi con la regione costante di un frammento di IgG1 mentre S1-C9 dai residui 261-672 fusi con C9) e successivamente per l’espressione transiente sono state trasfettate nelle cellule 293T e infine sono state estratte e purificate. Sono state utilizzate 2 librerie di frammenti variabili a catena singola (scFv) (in totale 2.7 x 1010 ) di cellule B di pazienti non immunizzati. I frammenti selezionati sono stati clonati in specifici vettori procariotici, espressi in E.coli e infine estratti e purificati. Successivamente cellule 293T sono state trasfettate con plasmidi codificanti per l’intera proteina S del SARS-CoV e con plasmidi codificanti per il recettore ACE2.

Le proteine ricombinanti S1-C9 sono state usate come antigeni per selezionare gli anticorpi dalle 2 librerie di ScFv di umani non immunizzati, il binding con S1 dei 288 scFvs selezionati è stato testato tramite ELISA. Sono stati identificati solo 8 scFvs anti S1 (6A,8C,12E,26H,27D,80R,91M,92N) la cui specificità di legame è stata confermata dall’ELISA con S1-C9 e S1-Ig. Gli 8 scFvs selezionati sono stati espressi in 2 vettori diversi (E. coli e Psyn1) e purificati tramite cromatografia di affinità.

Risultati: Tramite saggio di Micro-neutralizzazione (MN) è stato osservato che solo il frammento monovalente 80R tra gli 8 scFvs precedentemente selezionati possedeva attività neutralizzante. La velocissima clearance ematica di questo frammento però rappresentava una limitazione nell’essere impiegato nell’immunizzazione passiva perciò l’80R scFvs è stato convertito in una immonoglobulina bivalente umana completa (80R IgG1). l’affinità di legame per S1-Ig è stata misurata tramite risonanza plasmonica di superficie.(Biacore 3000, Uppsala Sweden). Da questa analisi si evince che IgG1 ha un incremento pari a 20 (Kd= 1.59 nM) nell’affinità di legame per S1 rispetto al frammento 80R (Kd= 32.3 nM) rendendo IgG1 comparabile per affinità di legame ad ACE2 (Kd= 1.70 nM). Nel saggio di microneutralizzazione l’80R IgG1si è dimostrato 20 volte più efficace dell’ 80R scFv. Siccome le cellule 293T che esprimono SARS-COV S possono fondersi con le cellule 293T che esprimono ACE2 è stato condotto un saggio di inibizione sulla formazione sinciziale con tutti gli 8 scFv.80R si è dimostrato l’unico frammento inibente la formazione dei sincizi e molto più potente del corrispettivo scFv nel bloccare la formazione sinciziale. Tramite citometria a flusso è stato osservato che l’ 80R scFv inibisce il legame S1-Ig alle cellule Vero E6 a concentrazioni di 15 mg/ml.Il legame tra S1-Ig e ACE2 è inibito specificamente da 80R scFv in maniera dose dipendente.

La caratterizzazione dell’epitopo 80 R evidenzia che il legame con la proteina S avviene soprattutto quando esso non è ridotto inoltre è emerso che non riconosce l’S1 (327)-Ig ma riconosce l’S1 (261-672)-Ig.

Conclusioni: Da risultati di questo studio emerge che la somministrazione passiva di anticorpi monoclonali umani anti-S1 con proprietà neutralizzanti potrebbe rappresentare un trattamento efficace ed immediato per l’infezione da SARS-CoV e inibiscono in modo efficace la formazione di sincizi bloccando il legame con il recettore. Saranno necessari test in vivo di conferma. 

About the Author

AIRI CLIP
Siamo un gruppo di medici, biologi, e ricercatori. Scriviamo in associazione con AIRIcerca in capacità privata (non rappresentiamo le rispettive istituzioni!) nel tentativo di aiutare i medici italiani che stanno affrontando l’epidemia Covid19. Controlliamo costantemente la letteratura scientifica e forniamo brevi riassunti in italiano peer-reviewed (troverete per ogni riassunto il nome di chi lo ha scritto e chi lo ha revisionato). Per agevolare la ricerca delle informazioni, assegnamo delle parole-chiave ad ogni riassunto. Speriamo in questo modo di fornire una versione concisa e in italiano di quanto di nuovo ha da offrire la letteratura scientifica sull’epidemia.

Be the first to comment on "Neutralizzazione del SARS coronavirus grazie ad un anticorpo monoclonale anti proteina S1 che ne blocca l’associazione con il recettore target"

Leave a comment

Your email address will not be published.