L’ultima Frontiera dell’ingegneria Genetica: Cos’e’ e a Cosa Serve il Sistema Crispr/Cas

di Elisa Dell’Aglio
Editors: Silvia Licciulli, Olivia Candini
Revisori Esperti: Matteo Bovolenta, Samanta Mariani, Mario Notari
Revisori Naive: Francesco Stermotich, Maria Rossana Caniglia, Nicola Ganci

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Il sistema CRISPR/Cas consente di modificare in modo rapido ed economico una precisa regione del DNA e ha catturato l’attenzione di tutta la comunità biotecnologica per la sua versatilità e le sue innumerevoli applicazioni. L’avvento di CRISPR/Cas apre però molti nuovi interrogativi di natura bioetica. Questo articolo vuole fornire un’introduzione generale al sistema e fare chiarezza sul suo utilizzo, sulle potenziali applicazioni in diversi campi e sulle relative controversie etiche.

Da meccanismo immunitario naturale a potente strumento biotecnologico
Per comprendere il funzionamento dei geni del nostro corpo e di qualsiasi organismo è importante studiare cosa accade quando se ne modifica l’espressione. Per secoli gli scienziati si sono dovuti accontentare di osservare gli effetti di mutazioni spontanee o di usare sostanze che introducevano errori casuali nel genoma di piante, animali o cellule in coltura. Negli ultimi anni sono state messe a punto nuove tecniche, dette di “genome editing”, che permettono di apportare modifiche precise ai geni che si vogliono studiare, velocizzando enormemente i progressi nella ricerca biologica. In futuro, queste tecniche potrebbero anche essere impiegate per “correggere” alterazioni responsabili di malattie geniche o modificare alcuni caratteri vegetali. Tra esse, il sistema più recente e promettente è noto come CRISPR/Cas.

Dietro questo strano nome si cela originariamente un meccanismo immunitario che alcuni organismi unicellulari (come i batteri) utilizzano per difendersi dai virus. Questi organismi contengono dei frammenti di RNA “guida” noti come CRISPR, che funzionano come delle sentinelle molecolari riconoscendo, per appaiamento di basi, le sequenze di DNA estraneo. Una volta riconosciuto e agganciato il DNA estraneo, le CRISPR guidano su di esso un enzima detto Cas (CRISPR-associated), una endonucleasi che, funzionando come un paio di forbici, taglia il DNA intruso, impedendone la replicazione. Le sequenze CRISPR furono scoperte già nel 1987 da Ishino e colleghi [footnote number=”1″ ]Ishino, Yoshizumi, et al. “Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.” Journal of bacteriology 169.12 (1987): 5429-5433[/footnote], ma il loro ruolo venne completamente compreso solo trent’anni dopo, nel 2007 [footnote number=”2″ ]Barrangou, Rodolphe, et al. “CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.” Science 315.5819 (2007): 1709-1712[/footnote].

Da allora e in particolare da quando, nel 2012, il sistema è stato reso personalizzabile dai gruppi di ricerca di Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier [footnote number=”3″ ]Jinek, Martin, et al. “A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity” Science, 337.6096 (2012), 816-821[/footnote], i biotecnologi stanno provando a sfruttare questo sistema di difesa naturale per introdurre modifiche specifiche nel genoma di organismi molto più complessi dei batteri, come animali e piante [footnote number=”4″ ]Gilbert, Luke A., et al. “CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.” Cell 154.2 (2013): 442-451[/footnote]. Per fare questo, si utilizza il sistema CRISPR accoppiato ai sistemi di riparazione del DNA presenti nella cellula, che, dopo il taglio da parte di Cas, operano una ricucitura secondo diversi meccanismi. Alcuni di questi meccanismi sono per natura imprecisi e introducono “errori” nella sequenza, cosicché a volte il gene modificato diventa non più funzionale. Questa modalità può essere sfruttata per eliminare l’espressione di un gene di cui si vuole studiare la funzione. Un altro meccanismo di riparazione, chiamato “ricombinazione omologa”, agisce con precisione, permettendo di riparare il taglio e di inserire sequenze desiderate. Grazie a questa strategia, è possibile non solo studiare l’effetto dell’introduzione di determinate mutazioni ma anche, ad esempio, correggere le mutazioni che causano malattie genetiche.

Figura 1 - Rappresentazione schematica di come si può sfruttare il sistema CRISPR-Cas per modificare il genoma di un organismo. Nel caso più semplice (in alto) dopo il taglio effettuato dall’enzima Cas il DNA è riparato mediante meccanismi cellulari imprecisi che possono portare a delezioni, inserzioni e/o sostituzione di nucleotidi con conseguente perdita di funzionalità del gene (“knock-out”). Nel secondo caso (in basso), insieme all'enzima Cas e alla sequenza CRISPR si introduce nella cellula anche una molecola di DNA contenente la sequenza desiderata. Questa molecola servirà da “stampo” per modificare il DNA delle cellule in modo preciso (mediante il processo della ricombinazione omologa).

Figura 1 – Rappresentazione schematica di come si può sfruttare il sistema CRISPR-Cas per modificare il genoma di un organismo. Nel caso più semplice (in alto) dopo il taglio effettuato dall’enzima Cas il DNA è riparato mediante meccanismi cellulari imprecisi che possono portare a delezioni, inserzioni e/o sostituzione di nucleotidi con conseguente perdita di funzionalità del gene (“knock-out”). Nel secondo caso (in basso), insieme all’enzima Cas e alla sequenza CRISPR si introduce nella cellula anche una molecola di DNA contenente la sequenza desiderata. Questa molecola servirà da “stampo” per modificare il DNA delle cellule in modo preciso (mediante il processo della ricombinazione omologa).

 

Il sistema è già stato utilizzato con successo per risolvere controversie scientifiche di lunga data [footnote number=”5″ ]Gao, Yangbin, et al. “Auxin binding protein 1 (ABP1) is not required for either auxin signaling or Arabidopsis development.” Proceedings of the National Academy of Sciences 112.7 (2015): 2275-2280[/footnote] e comprendere il ruolo di molti geni a funzione sconosciuta [footnote number=”6″ ]Swiech, Lukasz, et al. “In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9.” Nature biotechnology 33.1 (2015): 102-106[/footnote]. Si tratta di una vera e propria rivoluzione in ambito biotecnologico, che ha suscitato un interesse crescente, come dimostrato anche dalla rapida impennata nelle pubblicazioni : se il primo articolo scientifico che propone l’uso delle CRISPR per l’ingegneria genetica è stato pubblicato nel 2012, oggi il portale scientifico Pubmed conta già migliaia di referenze bibliografiche sull’argomento, tra articoli scientifici originali e review.

Il sistema CRISPR/Cas sta anche a poco a poco soppiantando metodi più obsoleti per studiare le cause genetiche e il decorso di malattie, come vari tipi di cancro (su modelli cellulari e animali), nonché l’efficacia di farmaci [footnote number=”7″ ]Sánchez-Rivera, Francisco J., and Tyler Jacks. “Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology.” Nature Reviews Cancer (2015)[/footnote]. Le maggiori probabilità di successo sono attese per la cura di malattie del sistema immunitario. Le cellule immunitarie, infatti, si possono isolare, modificare in vitro e reintrodurre nel paziente una volta “corrette”. Questa strategia ha già permesso di generare in vitro linfociti T resistenti all’HIV [footnote number=”8″ ]Schumann, Kathrin, et al. “Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences (2015): 201512503[/footnote].

In ambito vegetale, il sistema CRISPR/Cas mostra sorprendenti potenzialità. Non solo si rivela uno strumento importante per la ricerca di base, ma permette anche di generare piante con migliori caratteristiche nutrizionali o resistenti a patogeni, come nel caso di una recente varietà di pomodoro resistente all’oidio in corso di perfezionamento nei laboratori del Sainsbury Laboratory a Norwich (Gran Bretagna) [footnote number=”9″ ]Vladimir Nekrasov. “Tomelo- rapid generation of a tomato resistant to the powdery mildew by genome editing.” CRISPR/Cas Workshop, 7-8 September 2015, John Innes Centre, Norwich (GB)[/footnote]. Sebbene tutto ciò sia già in parte possibile con incroci tradizionali, il sistema CRISPR/Cas è molto più specifico e permette di ottenere i risultati in pochi mesi anziché anni. Inoltre, rispetto alle tecniche di biologia molecolare utilizzate finora, non necessita dell’introduzione di porzioni di DNA proveniente da altre specie, come geni per resistenze ad antibiotici o erbicidi. La stessa proteina Cas viene introdotta solo per il tempo necessario a correggere il genoma della pianta, ma può essere successivamente eliminata senza lasciare traccia, grazie degli incroci mirati con la pianta selvatica [footnote number=”10″ ]Belhaj, Khaoula, et al. “Editing plant genomes with CRISPR/Cas9.” Current opinion in biotechnology 32 (2015): 76-84[/footnote].

Figura 2 - Rappresentazione semplificata delle modifiche al DNA introdotte in una pianta OGM generata con tecniche tradizionali o mediante applicazione della tecnica CRISPR-Cas.

Figura 2 – Rappresentazione semplificata delle modifiche al DNA introdotte in una pianta OGM generata con tecniche tradizionali o mediante applicazione della tecnica CRISPR-Cas.

 

CRISPR/Cas su embrioni umani: un difficile conflitto etico
Nonostante tutti questi promettenti risultati, a far conoscere il sistema CRISPR/Cas al grande pubblico è stato uno studio molto controverso apparso nell’aprile 2015 sulla rivista Protein&Cell. I ricercatori, un’équipe cinese diretta dal Prof. Junjiu Huang, hanno provato a utilizzare la tecnica per correggere la mutazione genica della beta talassemia (nota anche come anemia mediterranea) in embrioni umani non vitali, ovvero destinati alla ricerca e non in grado di svilupparsi [footnote number=”11″ ]Liang, Puping, et al. “CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.” Protein & cell (2015): 1-10[/footnote]. Le conclusioni dello studio erano positive, in quanto alcuni degli embrioni sottoposti a taglio CRISPR/Cas e ricombinazione omologa avevano sostituito il gene corretto a quello mutato ed erano quindi “guariti”. I numeri, però, erano impietosi: solo 28 embrioni su 54 avevano subito il taglio di Cas e solo in quattro embrioni alcune cellule avevano effettuato la ricombinazione omologa riparatrice.

Si era anche osservato un alto numero di mutazioni indesiderate potenzialmente pericolose. Questi problemi sono dovuti al fatto che l’enzima Cas a volte non è in grado di distinguere tra la sequenza-bersaglio, che non può eccedere le 20 paia di basi, e un frammento di DNA molto simile. Più il genoma è lungo, più è alta la probabilità di trovarvi più copie della sequenza bersaglio o sequenze simili (il genoma degli organismi unicellulari che usano CRISPR/Cas a scopi difensivi è in media 1000 volte più piccolo di quello di piante e animali).

Nel riportare i risultati dello studio, la stampa italiana e internazionale ha spesso usato toni allarmanti dovuti alla bassa efficacia della tecnica e all’alto rischio di errore. Di certo è ancora presto per pensare a delle applicazioni terapeutiche a livello embrionale ma i numeri dello studio di Huang e colleghi non scoraggiano gli esperti, i quali sono comunque pienamente coscienti dei difetti attuali del sistema CRISPR/Cas e hanno già proposto molte promettenti strategie di miglioramento. Contemporaneamente, una sempre più ampia conoscenza dei genomi permette di scegliere con maggiore accortezza la sequenza bersaglio.

Sul piano bioetico, però, anche alcuni scienziati hanno reagito con preoccupazione all’articolo di Huang e colleghi. In questo caso, gli embrioni umani usati non avrebbero potuto svilupparsi e dare origine a una nuova vita, ma in futuro altri scienziati potrebbero voler tentare di applicare la tecnica anche su embrioni normali. Lo studio riporta quindi alla luce il grosso dilemma dell’eugenetica, ovvero se sia lecito effettuare modifiche genetiche sull’uomo (anche se solo a scopo terapeutico o di ricerca di base) e se studi di tale genere debbano essere incoraggiati e resi pubblici. Secondo quanto dichiarato dagli stessi autori del discusso articolo, le prestigiose riviste Nature e Science avrebbero rifiutato la pubblicazione della ricerca proprio per ragioni etiche.

 

OGM oppure no?
In ambito agronomico, il metodo CRISPR/Cas scatena meno problemi etici ma sta complicando l’aspro dibattito sugli OGM. Le mutazioni introdotte da questa tecnica possono infatti essere così piccole e localizzate da diventare indistinguibili da quelle “naturali”, dovute cioè a fattori di stress come un eccessivo irraggiamento solare.

Queste mutazioni sarebbero sufficienti per classificare tali piante come OGM? Per ora, gli Stati Uniti sembrano propendere per il no, mentre in Europa si va in direzione del sì, in quanto per l’Unione Europea un OGM è definito tale non in base alle caratteristiche finali del prodotto ma in base alla tecnologia scelta per generarlo. Nella Direttiva 2001/18/CE del Parlamento europeo e del Consiglio del 12 marzo 2001 si legge infatti che OGM è ogni organismo “il cui materiale genetico è stato modificato in modo diverso da quanto avviene in natura con l’accoppiamento e/o la ricombinazione genetica naturale”.

Le norme vigenti sono però state adottate in un’epoca in cui il sistema CRISPR/Cas era ancora sconosciuto e quindi non era stato preso in considerazione. Se, come previsto, i centri di ricerca pubblici e privati genereranno, a breve, piante di interesse commerciale con questo sistema sarà necessario colmare il vuoto legislativo sia in Europa sia nel resto del mondo, in modo da disciplinare la produzione e l’immissione sul mercato di questi prodotti.

Alcune compagnie stanno già cercando di approfittare il più possibile dell’attuale inadeguatezza nelle regolamentazioni per acquisire notorietà e guadagnare mercato. È il caso di Cibus, un’industria biotecnologica statunitense con filiale in Olanda che utilizza un sistema di modifica genetica mirato detto “Rapid Trait Development System”, di fatto molto simile a CRISPR/Cas. L’azienda ha già immesso sul mercato americano una varietà di manioca resistente a un erbicida e sul suo sito internet sponsorizza i propri prodotti sottolineandone l’accettabilità anche in Paesi contrari agli OGM, in quanto “non transgenici”.

 

Interrogativi ecologici
L’utilizzo più controverso di CRISPR/Cas è forse quello in cui il sistema è “autoreplicante” [footnote number=”12″ ]Gantz, Valentino M., and Ethan Bier. “The mutagenic chain reaction: A method for converting heterozygous to homozygous mutations.” Science 348.6233 (2015): 442-444[/footnote]. In questo caso, una copia del gene Cas e della sua sequenza guida si inseriscono all’interno del genoma della cellula bersaglio. Ad ogni generazione successiva, il meccanismo può quindi riattivarsi e riprodurre la mutazione nel 100% della progenie. I vantaggi sarebbero enormi, non solo nella biotecnologia vegetale ma anche, e forse soprattutto, per il controllo degli insetti.

Ciò consentirebbe, ad esempio, di mutare le zanzare in modo da renderle immuni al plasmodio portatore della malaria (come è già stato fatto con successo in laboratorio [footnote number=”13″ ]Gantz, Valentino M., et al. “Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.” Proceedings of the National Academy of Sciences 112.49 (2015): E6736-E6743[/footnote]), e debellare così la malattia, oppure rendere completamente innocui insetti pericolosi per le coltivazioni. Allo stesso modo si potrebbe agire su altri vettori di malattie come il virus Zika. La scarsa prevedibilità delle conseguenze ecologiche suggerisce però di procedere in questo settore con molta cautela.

 

Una sfida non solo scientifica
A meno di cinque anni dal primo studio biotecnologico che ne fece uso, CRISPR/Cas sta rivoluzionando l’ingegneria genetica e nel prossimo futuro promette di essere la base per importanti innovazioni in ambito terapeutico, alimentare ed ecologico. Al contempo, sta però anche smantellando la frontiera tra terapie e eugenetica e quella tra OGM e alimenti tradizionali, aprendo così nuovi interrogativi, anche di tipo ecologico.

I ricercatori, in particolare coloro che sono stati protagonisti della scoperta di CRISP/Cas, sono coscienti delle difficoltà e stanno cercando di creare i giusti spazi per discutere in maniera chiara e aperta delle nuove sfide di CRISPR/Cas (l’ultimo congresso sull’argomento si è tenuto a Washington D.C. lo scorso dicembre). Gli sviluppi di questa nuova tecnologia non dipenderanno, quindi, soltanto dai risultati sperimentali ma anche dall’esito di un urgente dialogo tra scienza e società, a cui siamo tutti invitati.

Bibliografia

[1] Ishino, Yoshizumi, et al. “Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.” Journal of bacteriology 169.12 (1987): 5429-5433.

[2] Barrangou, Rodolphe, et al. “CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.” Science 315.5819 (2007): 1709-1712.

[3] Jinek, Martin, et al. “A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity.” Science, 337.6096 (2012), 816-821.

[4] Gilbert, Luke A., et al. “CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.” Cell 154.2 (2013): 442-451.

[5] Gao, Yangbin, et al. “Auxin binding protein 1 (ABP1) is not required for either auxin signaling or Arabidopsis development.” Proceedings of the National Academy of Sciences 112.7 (2015): 2275-2280.

[6] Swiech, Lukasz, et al. “In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9.” Nature biotechnology 33.1 (2015): 102-106.

[7] Sánchez-Rivera, Francisco J., and Tyler Jacks. “Applications of the CRISPR-Cas9 system in cancer biology.” Nature Reviews Cancer (2015).

[8] Schumann, Kathrin, et al. “Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.” Proceedings of the National Academy of Sciences (2015): 201512503.

[9] Vladimir Nekrasov. “Tomelo- rapid generation of a tomato resistant to the powdery mildew by genome editing.” CRISPR/Cas Workshop, 7-8 September 2015, John Innes Centre, Norwich (GB).

[10] Belhaj, Khaoula, et al. “Editing plant genomes with CRISPR/Cas9.” Current opinion in biotechnology 32 (2015): 76-84.

[11] Liang, Puping, et al. “CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.” Protein & cell (2015): 1-10.

[12] Gantz, Valentino M., and Ethan Bier. “The mutagenic chain reaction: A method for converting heterozygous to homozygous mutations.” Science 348.6233 (2015): 442-444.

[13] Gantz, Valentino M., et al. “Highly efficient Cas9-mediated gene drive for population modification of the malaria vector mosquito Anopheles stephensi.” Proceedings of the National Academy of Sciences 112.49 (2015): E6736-E6743.

Info sui Revisori di questo articolo

Matteo Bovolenta è Ricercatore presso il Dipartimento di Scienze della vita e Biotecnologie

dell’Università di Ferrara.

Samanta Mariani è Post-doc al Centre for Inflammation Research all’Università di Edinburgo.

Mario Notari è Post-doc al Centro Medicina Rigenerativa di Barcellona (CMRB).

Francesco Stermotich è Dottorando presso il dipartimento di Islamic & Middle Eastern Studies, Università di Edinburgo.

Maria Rossana Caniglia lavora come Dottore di ricerca in Conservazione dei Beni Architettonici e Ambientali, Università degli studi Mediterranea di Reggio Calabria.

Nicola Ganci, Laureato in Storia e Master in Giornalismo, si occupa di enogastronomia e copywriting.

About the Author

Elisa Dell'Aglio
Sin dai primi anni dell’università, Elisa si è dedicata alla comprensione dei meccanismi che permettono alla piante di adattarsi alle condizioni ambientali anche senza potersi muovere. Le sue prime ricerche, condotte presso il Dipartimento di Scienze della Vita e Biologia dei Sistemi a Torino, vertevano sulle relazioni simbiotiche che i vegetali stabiliscono con funghi del suolo per facilitare l’assorbimento radicale di fosfato e composti azotati. Con una borsa di dottorato internazionale, nel 2010 si è poi trasferita in Francia (Commissariat à l’Energie Atomique et aux Energies Alternatives di Grenoble), dove ha messo a punto tecniche biofisiche per lo studio delle interazioni proteiche e la regolazione di enzimi fotosintetici. Dopo un Master in Traduzione tecnico-scientifica e uno stage presso la redazione del mensile Le Scienze, attualmente lavora all’Università di Ginevra come Post-Doc. Il suo progetto verte sui meccanismi che regolano la produzione di vitamine nelle piante in risposta a stress ambientali, utilizzando anche le più avanzate tecniche di genome editing come il sitema CRISPR/Cas.

1 Comment on "L’ultima Frontiera dell’ingegneria Genetica: Cos’e’ e a Cosa Serve il Sistema Crispr/Cas"

  1. Articolo molto chiaro per tutti. Ottimo lavoro!

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