Inibire i meccanismi di riparazione del DNA: una nuova speranza per i pazienti affetti da leucemie

di Maria Teresa Esposito
Revisionato da Silvia Sironi e Silvia Licciulli

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Sono un docente universitario presso la University of East London (Inghilterra), dove mi occupo di biologia del cancro. Questo è il mio lavoro di ricerca svolto come ricercatrice post-doc al King’s College London (Inghilterra).  La ricerca di cui vi parlo in questo articolo è stata pubblicata questo mese su Nature medicine, e tratta di uno studio pre-clinico verso l’utilizzo di un nuovo farmaco  per i pazienti affetti da leucemia mieloide acuta  (LMA) e per quelli affetti dalle aggressive leucemie mieloidi/linfoidi (MLL).

Decenni di ricerche hanno portato a enormi progressi nella comprensione della patogenesi e nella terapia delle leucemie, i tumori del sangue. In seguito all´accumulo di mutazioni geniche o anomalie cromosomiche a livello delle cellule immature del sangue (le cellule staminali o progenitori, anche dette “blasti”) (Figura 1), queste si trasformano in cellule leucemiche, dando inizio alla malattia. Nelle leucemie si osserva un enorme aumento del numero delle cellule leucemiche a danno delle cellule normali (Figura 2). A secondo del tipo di progenitore leucemico interessato, si distinguono le leucemie linfoidi, che colpiscono i progenitori dei linfociti, e le leucemie mieloidi, che colpiscono i granulociti. Un’ulteriore classificazione delle leucemie si basa sulla velocità con la quale il progenitore leucemico si espande.: nelle leucemie acute questo avviene rapidamente mentre in quelle croniche il decorso è più lento [footnote number=”1″ ]Freireich, E.J., Wiernik, P.H., and Steensma, D.P. (2014). The leukemias: a half-century of discovery. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 32, 3463-3469[/footnote].

Figura 1 - Schema della ematopoiesi. L’ematopoiesi è il processo attraverso il quale a partire da una cellula immatura o staminale si originano tutte le cellule del sangue. Il meccanismo segue uno schema gerarchico caratterizzato in maniera semplificata da due stazioni intermedie, il progenitore mieloide e quello linfoide. Attraverso un processo di maturazione questi progenitori danno origine alle cellule mature del sangue.

Figura 1 – Schema della ematopoiesi. L’ematopoiesi è il processo attraverso il quale a partire da una cellula immatura o staminale si originano tutte le cellule del sangue. Il meccanismo segue uno schema gerarchico caratterizzato in maniera semplificata da due stazioni intermedie, il progenitore mieloide e quello linfoide. Attraverso un processo di maturazione questi progenitori danno origine alle cellule mature del sangue.

Questi tumori sono per fortuna relativamente rari, con una incidenza di circa 2-10 casi ogni 100.000 individui adulti in Europa, anche se purtroppo nei bambini rappresentano il tumore più frequente dopo quelli del cervello e purtroppo le terapie, in particolare nei casi pediatrici, non sono ancora ottimali.

Intense ricerche hanno portato a importanti risultati nel campo delle leucemie. Soprattutto per quanto riguarda le leucemie infantili, ed in particolare nel caso della leucemia linfoide acuta, il tasso di sopravvivenza a 5 anni è quasi raddoppiato nell’ultimo decennio, passando dal 57% tra gli anni 1975 e 1979, al 90% tra gli anni 2003 e 2009. La leucemia è stato il primo modello di tumore di cui sono state identificate le cellule staminali [footnote number=”2″ ]Bonnet, D., and Dick, J.E. (1997). Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature medicine 3, 730-737[/footnote] e dagli studi in questo campo ha avuto origine l’ipotesi generale che i tumori derivino da una espansione incontrollata di una cellula staminale. La leucemia è anche il primo tumore il cui genoma è stato completamente sequenziato [footnote number=”3″ ]Mardis, E.R., Ding, L., Dooling, D.J., Larson, D.E., McLellan, M.D., Chen, K., Koboldt, D.C., Fulton, R.S., Delehaunty, K.D., McGrath, S.D., et al. (2009). Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome. The New England journal of medicine 361, 1058-1066[/footnote], un traguardo importantissimo verso la ricerca di nuovi bersagli terapeutici. Nel 1973 fu scoperta la prima traslocazione cromosomica associata allo sviluppo di una leucemia, una mutazione in cui un pezzo di cromosoma 8 si trova fuso al cromosoma 21. Questa anomalia dà origine a una proteina detta appunto “di fusione” che ha capacità tumorigeniche [footnote number=”4″ ]Rowley, J.D. (1973a). Identificaton of a translocation with quinacrine fluorescence in a patient with acute leukemia. Annales de genetique 16, 109-112[/footnote], cioè è in grado di indurre una trasformazione maligna della cellula che la contiene. In seguito è stato osservato che circa la metà dei pazienti affetti da leucemia presenta anomalie cromosomiche analoghe e che le stesse possono avere un valore prognostico, tanto che la diagnosi genetica è offerta di routine a tutti i pazienti affetti da leucemia. Successivamente altre traslocazioni cromosomiche sono state identificate, tra cui il famoso cromosoma Philadelphia, derivato dalla traslocazione che coinvolge i cromosomi 9 e 22 e che da origine alla proteina di fusione BCR-ABL, che possiede un’attività enzimatica incontrollata [footnote number=”5″ ]Rowley, J.D. (1973b). Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 243, 290-293[/footnote]. Uno dei più grandi traguardi nell’ambito delle leucemie è stato lo sviluppo del primo inibitore contro l’enzima BCR-ABL, un farmaco (chiamato Imatinib) che ha drasticamente cambiato la prognosi dei pazienti affetti da leucemia caratterizzata dalla presenza del cromosoma Philadelphia, portando le chance di sopravvivenza da meno del 5% ad oltre l’80% [footnote number=”6″ ]Druker, B.J., Tamura, S., Buchdunger, E., Ohno, S., Segal, G.M., Fanning, S., Zimmermann, J., and Lydon, N.B. (1996). Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature medicine 2, 561-566[/footnote].

Figura 2 - Striscio di sangue di un paziente affetto da leucemia mieloide acuta. Il sangue dei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta è caratterizzato dalla massiccia presenza di cellule leucemiche a danno dei globuli rossi che costituiscono le cellule normalmente più abbondanti.

Figura 2 – Striscio di sangue di un paziente affetto da leucemia mieloide acuta. Il sangue dei pazienti affetti da leucemia mieloide acuta è caratterizzato dalla massiccia presenza di cellule leucemiche a danno dei globuli rossi che costituiscono le cellule normalmente più abbondanti.

Nonostante oggigiorno la conoscenza delle leucemie si è notevolmente ampliata, purtroppo non ci sono stati grandi sviluppi a livello terapeutico, fatta eccezione di Imatinib e poche altre molecole. La terapia continua a essere la stessa proposta decenni fa: chemioterapia e trapianto di midollo osseo, con tutte le complicazioni che essi comportano, soprattutto nei bambini. E’ di questo aspetto che mi sono affascinata ed in questo ho investito gli ultimi 6 anni della mia vita: capire le leucemie, in particolare come fa una cellula staminale a diventare leucemica e proporre una terapia alternativa alla chemioterapia. Al King’s College London (Inghilterra) ho svolto la mia ricerca sulla leucemia mieloide acuta (LMA), occupandomi anche di un sottogruppo molto aggressivo, quello delle traslocazioni cromosomiche che colpiscono il gene MLL. Tramite l’utilizzo di tecniche di biologia cellulare, molecolare e di modelli animali, insieme al mio gruppo, ho individuato quella che in gergo scientifico si chiama “gene signature”, letteralmente la firma genetica delle leucemie MLL, cioè i geni che sono espressi in modo caratteristico in questo gruppo di leucemie. Tra questi abbiamo individuato un bersaglio terapeutico, il gene Beta catenina [footnote number=”7″ ]Yeung, J., Esposito, M.T., Gandillet, A., Zeisig, B.B., Griessinger, E., Bonnet, D., and So, C.W. (2010). beta-Catenin mediates the establishment and drug resistance of MLL leukemic stem cells. Cancer cell 18, 606-618[/footnote]. Un approccio simile era stato utilizzato alcuni anni prima da un altro gruppo. Gli autori di questo studio . Questo aspetto ha destato il mio interesse. In altri tipi di tumori come per esempio quelli del seno, sono state caratterizzate mutazioni a carico dei geni coinvolti in uno dei tanti meccanismi di riparazione del DNA. I tumori portatori di queste mutazioni sono particolarmente sensibili a farmaci che inibiscono altri meccanismi di riparazione del DNA, in particolare una nuova classe di inibitori, quelli che colpiscono la Poli-ADP Ribosio Polimerasi 1 (PARP1) [footnote number=”8″ ]Farmer, H., McCabe, N., Lord, C.J., Tutt, A.N., Johnson, D.A., Richardson, T.B., Santarosa, M., Dillon, K.J., Hickson, I., Knights, C., et al. (2005). Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature 434, 917-921[/footnote][footnote number=”9″ ]Bryant, H.E., Schultz, N., Thomas, H.D., Parker, K.M., Flower, D., Lopez, E., Kyle, S., Meuth, M., Curtin, N.J., and Helleday, T. (2005). Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature 434, 913-917[/footnote]. Il concetto è relativamente semplice: le nostre cellule sono dotate di vari meccanismi preposti al riparazione del DNA. Se il meccanismo X è compromesso, la sopravvivenza delle cellule dipenderà fortemente da un altro meccanismo Y (Figura 3 A-B). Ma se noi inibiamo anche il meccanismo Y, le cellule rimangono a corto di sistemi di riparazione del DNA e allora cosa succede? Se il danno accumulato è troppo ingente, le cellule vanno incontro a morte. (Figura 3 C). In altre parole questa terapia non “guarisce” le cellule del cancro ma le danneggia al punto tale che esse stesse non abbiano altra scelta che morire.

Figura 3 - Meccanismo di azione degli inibitori del riparo del DNA. In una cellula normale il danno al DNA può essere riparato da molti meccanismi diversi. BER, meccanismo di escissione delle basi, è uno dei più usati per riparare danni alle basi del DNA. La ricombinazione omologa (HR) è un meccanismo che viene utilizzato dalle cellule in attiva fase di replicazione in risposta a un danno che danneggia la struttura a doppia elica del DNA (A). Una cellula che presenta un difetto nel meccanismo HR è in grado di sopravvivere grazie all’impiego di meccanismi di riparo alternativi (B). Nelle cellule trattate con gli inibitori PARP1 (PARPi), il meccanismo BER è inattivato. Questo provoca un accumulo di piccole mutazioni che la cellula può riparare pressoché esclusivamente tramite HR. Poiché la cellula trattata ha contemporaneamente un difetto nel sistema HR, essa non sarà in grado di tollerare tutto il danno accumulato e non potrà fare altro che morire (C).

Figura 3 – Meccanismo di azione degli inibitori del riparazione del DNA. In una cellula normale il danno al DNA può essere riparato da molti meccanismi diversi. BER, meccanismo di escissione delle basi, è uno dei più usati per riparare danni alle basi del DNA. La ricombinazione omologa (HR) è un meccanismo che viene utilizzato dalle cellule in attiva fase di replicazione in risposta a un danno che danneggia la struttura a doppia elica del DNA (A). Una cellula che presenta un difetto nel meccanismo HR è in grado di sopravvivere grazie all’impiego di meccanismi di riparazione alternativi (B). Nelle cellule trattate con gli inibitori PARP1 (PARPi), il meccanismo BER è inattivato. Questo provoca un accumulo di piccole mutazioni che la cellula può riparare pressoché esclusivamente tramite HR. Poiché la cellula trattata ha contemporaneamente un difetto nel sistema HR, essa non sarà in grado di tollerare tutto il danno accumulato e non potrà fare altro che morire (C).

 

Nel mio progetto di ricerca ho dimostrato che le cellule leucemiche caratterizzate dalle traslocazioni cromosomiche AML1-ETO e PML-RARα esibiscono dei difetti in un sistema di riparazione del DNA chiamato “ricombinazione omologa” (HR), il che le rende sensibili all’azione degli inibitori di PARP1, un enzima coinvolto nel meccanismo di riparazione del DNA mediato da “escissione delle basi “(BER) [footnote number=”10″ ]Helleday, T. (2011). The underlying mechanism for the PARP and BRCA synthetic lethality: clearing up the misunderstandings. Molecular oncology 5, 387-393[/footnote]. Siamo riusciti a dimostrare questo effetto in vitro, non solo in cellule provenienti da modelli animali, ma anche in linee cellulari umane e in campioni di cellule prelevate direttamente dai pazienti. Inoltre il trattamento in vivo con gli inibitori di PARP1 prolunga la sopravvivenza dei modelli animali. Cosa succede invece alle aggressive leucemie MLL? Queste leucemie sono resistenti all’azione degli inibitori di PARP1, ma io sono molto testarda e ho voluto cercare di capire perché lo siano. Le leucemie MLL sono caratterizzate dall’attivazione di un gene, HoxA9, che ne rappresenta la firma genetica. Quando ho forzato l’attivazione del gene HoxA9 nelle cellule leucemiche AML1-ETO e PML-RARα, queste cellule sono diventate resistenti agli inibitori di PARP1. Similmente, spegnendo l’espressione del gene HoxA9 nelle leucemie MLL queste cellule diventano sensibili all’attacco degli inibitori di PARP1 e presentano diverse caratteristiche che indicano che il meccanismo di ricombinazione omologa è compromesso. Basta quindi dare ai pazienti MLL una combinazione di inibitori di PARP1 e di inibitori di HoxA9 e il gioco è fatto? Non proprio. HoxA9 è un fattore di trascrizione e ad oggi non è possibile produrre inibitori selettivi di questa proteina, ma con il mio gruppo siamo riusciti ad aggirare questo problema utilizzando altri inibitori che inattivano HoxA9 con meccanismi alternativi. La combinazione di inibitori di PARP1 e HoxA9 induce le cellule leucemiche MLL a differenziare e di conseguenza a perdere la capacità di crescere in maniera incontrollata [footnote number=”11″ ]Esposito, M.T., Zhao, L., Fung, T.K., Rane, J.K., Wilson, A., Martin, N., Gil, J., Leung, A.Y., Ashworth, A., and Eric So, C.W. (2015). Synthetic lethal targeting of oncogenic transcription factors in acute leukemia by PARP inhibitors. Nature medicine[/footnote].

I risultati sono molto soddisfacenti ma c’è tanto ancora da fare! Gli inibitori di PARP1 sono stati recentemente approvati per uso clinico in Europa per il tumore dell’ovaio. Sono stati anche testati nelle leucemie ma senza selezionare i pazienti per mutazioni genetiche, cosa necessaria visto che il mio studio e molti altri hanno dimostrato che solo alcuni pazienti potranno trarre un vero beneficio da questi inibitori. E per le leucemie MLL? C’è ancora da lavorare sui meccanismi che rendono queste cellule così resistenti alla chemioterapia ma la mia ricerca ha prodotto in parte una spiegazione: la capacità di alterare i meccanismi di riparazione del DNA.

Concludo con il motto di Bloodwise, la ONLUS che ha contribuito a finanziare questo progetto: “ Non ci fermeremo finché non avremo sconfitto i tumori del sangue”.

Bibliografia

[1] Freireich, E.J., Wiernik, P.H., and Steensma, D.P. (2014). The leukemias: a half-century of discovery. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 32, 3463-3469.

[2] Bonnet, D., and Dick, J.E. (1997). Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nature medicine 3, 730-737.

[3] Mardis, E.R., Ding, L., Dooling, D.J., Larson, D.E., McLellan, M.D., Chen, K., Koboldt, D.C., Fulton, R.S., Delehaunty, K.D., McGrath, S.D., et al. (2009). Recurring mutations found by sequencing an acute myeloid leukemia genome. The New England journal of medicine 361, 1058-1066.

[4] Rowley, J.D. (1973a). Identificaton of a translocation with quinacrine fluorescence in a patient with acute leukemia. Annales de genetique 16, 109-112.

[5] Rowley, J.D. (1973b). Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 243, 290-293.

[6] Druker, B.J., Tamura, S., Buchdunger, E., Ohno, S., Segal, G.M., Fanning, S., Zimmermann, J., and Lydon, N.B. (1996). Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Bcr-Abl positive cells. Nature medicine 2, 561-566.

[7] Yeung, J., Esposito, M.T., Gandillet, A., Zeisig, B.B., Griessinger, E., Bonnet, D., and So, C.W. (2010). beta-Catenin mediates the establishment and drug resistance of MLL leukemic stem cells. Cancer cell 18, 606-618.

[8] Farmer, H., McCabe, N., Lord, C.J., Tutt, A.N., Johnson, D.A., Richardson, T.B., Santarosa, M., Dillon, K.J., Hickson, I., Knights, C., et al. (2005). Targeting the DNA repair defect in BRCA mutant cells as a therapeutic strategy. Nature 434, 917-921.

[9] Bryant, H.E., Schultz, N., Thomas, H.D., Parker, K.M., Flower, D., Lopez, E., Kyle, S., Meuth, M., Curtin, N.J., and Helleday, T. (2005). Specific killing of BRCA2-deficient tumours with inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase. Nature 434, 913-917.

[10] Helleday, T. (2011). The underlying mechanism for the PARP and BRCA synthetic lethality: clearing up the misunderstandings. Molecular oncology 5, 387-393.

[11] Esposito, M.T., Zhao, L., Fung, T.K., Rane, J.K., Wilson, A., Martin, N., Gil, J., Leung, A.Y., Ashworth, A., and Eric So, C.W. (2015). Synthetic lethal targeting of oncogenic transcription factors in acute leukemia by PARP inhibitors. Nature medicine.

About the Author

Maria Teresa Esposito
Maria Teresa Esposito ha conseguito il dottorato presso la SEMM, Scuola Europea di Medicina Molecolare (sede di Napoli- CEINGE), studiando le cellule mesenchimali staminali e il loro impiego nella medicina rigenerativa. È ora ricercatrice post-doc al King’s College di Londra dove continua a occuparsi di cellule staminali, ma nel contesto di un tumore ematologico, la leucemia mieloide acuta. Accanita sostenitrice della divulgazione scientifica, oltre ad AIRInforma collabora con diverse riviste e blog, tra cui Orizzonti Biotecnologici, LabLit, Oxbridge Roundtable Review e STEMnet blog. Presenzia a giornate di orientamento universitario nelle scuole, dove racconta il suo viaggio nella scienza e per la scienza.

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