Vantaggi e limiti delle moderne tecniche di microscopia ottica

di Marco Grison e Leone Rossetti
Editor: Federico Forneris
Revisori Esperti: Giorgia Palano, Matteo Campioni
Revisore Naive: Maria Rossana Caniglia
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L’utilizzo di animazioni per accompagnare lezioni, pubblicazioni e convegni sta diventando sempre più popolare tra gli scienziati che si occupano di Biologia Molecolare. Non abbiamo ancora modo di osservare direttamente il comportamento delle singole molecole, motivo per cui l’utilizzo della cosiddetta computer generated imagery aiuta la visualizzazione e quindi la comprensione dei processi molecolari su piccola scala. Questi affascinanti video non sono che una ricostruzione di ciò che avviene nelle nostre cellule nell’ordine del nanometro, ossia un miliardesimo di metro. Solo grazie alla combinazione di molteplici tecniche ed allo studio di centinaia di pubblicazioni è possibile accumulare le informazioni necessarie per creare animazioni di una tale accuratezza. In questo articolo introduciamo le problematiche tipiche della microscopia, spiegando poi quali sono i limiti intrinseci a ogni sistema ottico. Questo articolo costituisce la prima parte di una mini-serie. Nella seconda parte, ci addentreremo nei principi della microscopia a fluorescenza, requisito fondamentale per comprendere le scoperte alla base della superrisoluzione che hanno determinato l’assegnazione del Premio Nobel per la chimica 2014.

La prima parte di questo articolo si propone di presentare la tematica della microscopia in campo biologico, partendo dalle motivazioni per il suo utilizzo. In seguito viene spiegato il funzionamento basilare di un microscopio e il principio fisico che ci impedisce di osservare oggetti arbitrariamente piccoli.

 

1. Osservare il corpo umano

Per studiare la fisiologia degli organismi è fondamentale poter visualizzare le componenti a diversi livelli (tessuti, cellule, molecole) cercando di rispondere alle seguenti domande:

  • Come è fatto?
  • Come funziona?

Per capire meglio la struttura è spesso sufficiente cogliere un’istantanea del sistema, anche a costo di immobilizzarlo in un determinato stato. Da un punto di vista tecnico questo facilita notevolmente l’acquisizione di immagini, proprio come fare una fotografia di un’auto in movimento è più difficile che ritrarla parcheggiata. D’altra parte, fissare il sistema in un determinato stato preclude lo studio della sua dinamica.

Per comprendere la funzione di un determinato meccanismo biologico è necessaria la capacità di seguire l’evoluzione del sistema nelle sue fasi. Ad esempio, per comprendere a fondo il meccanismo del muscolo non basta conoscerne la struttura, ma bisogna poter osservare l’intero tessuto durante la fase di contrazione e allungamento, a diversi livelli di profondità: come le fibre muscolari si ridistribuiscono durante lo sforzo, come le cellule si contraggono e interagiscono e come le singole proteine si legano tra loro. Un paio di esempi si possono trovare qui o qui.

 

Microscopia ottica
Lo scopo della microscopia è quello di rivelare all’osservatore informazioni riguardo alla disposizione della materia nello spazio, e ai suoi spostamenti. Si può pensare al microscopio come al prolungamento dell’occhio umano, capace di portarlo a guardare nel mondo del piccolo e del piccolissimo.

La microscopia ottica sfrutta l’interazione della luce visibile con la materia per riverlarne i dettagli più piccoli. In molte scuole viene fatta vedere al microscopio la pellicola presente tra due strati di una cipolla: illuminando il campione omogeneamente (a campo largo, o bright field) come nello schema in figura 1A, si distinguono chiaramente le diverse cellule, con i loro nuclei e la membrana che le delimita. Questo perchè le zone più dense di materiale biologico come le membrane (o il nucleo) assorbono maggiormente la luce.

Figura 1 - (A) Schema di funzionamento dell’illuminazione a campo largo: le zona centrale più densa di materiale assorbe più luce e risulta quindi più scura nell’immagine. (B) Immagine al microscopio ottico di uno strato di cellule di cipolla. Il contrasto è dato dal fatto che zone più dense di materiale biologico (in questo caso membrana e nucleo) assorbono più luce.

Figura 1 – (A) Schema di funzionamento dell’illuminazione a campo largo: le zona centrale più densa di materiale assorbe più luce e risulta quindi più scura nell’immagine. (B) Immagine al microscopio ottico di uno strato di cellule di cipolla. Il contrasto è dato dal fatto che zone più dense di materiale biologico (in questo caso membrana e nucleo) assorbono più luce.

 

L’utilizzo di luce nell’intervallo di lunghezze d’onda 400nm–700nm (figura 2), ovvero lo spettro della luce visibile, ha due principali vantaggi: permette al campione di non essere danneggiato e di essere osservato direttamente dal nostro occhio, motivo per cui la microscopia ottica con luce visibile è tuttora una scelta comune in campo biologico.

Figura 2 - Spettro delle lunghezze d’onda e frequenze delle onde elettromagnetiche. La luce visibile va dai 400 nm del violetto ai 700 nm del rosso.

Figura 2 – Spettro delle lunghezze d’onda e frequenze delle onde elettromagnetiche. La luce visibile va dai 400 nm del violetto ai 700 nm del rosso.

 

Perché andare oltre
Il principale difetto della microscopia ottica è che molti oggetti di interesse scientifico (non solo biologico) sono troppo piccoli per essere osservati con questa tecnica. La superrisoluzione è un tentativo di potenziare la microscopia ottica per riuscire a vedere anche molti di questi oggetti. Questo sviluppo tecnologico mantiente tutti vantaggi dei microscopi con luce visibile, tra cui quello fondamentale di monitorare un campione biologico in condizioni fisiologiche per ore senza danneggiarlo. I più recenti sviluppi hanno già portato ad applicare questa tecnica su campioni in vivo.

 

Non solo luce visibile
I lettori più esperti si saranno accorti che non sono state menzionate altre tecniche di microscopia, ad esempio i raggi X e la microscopia a elettroni. Con questi metodi si possono effettivamente distinguere oggetti più piccoli di quelli osservabili con la microscopia ottica, quindi prima di entrare ulteriormente nei dettagli della superrisoluzione introduciamo a titolo di esempio la microscopia a raggi X, per mostrarne le potenzialità e i limiti.

Nel novembre 1895 Wilhelm Röntgen scoprì per caso un tipo di radiazione elettromagnetica che poteva attraversare la sua mano. Li chiamò raggi X, dal momento che la loro natura gli era sconosciuta (e rimase tale per quindici anni). Un mese dopo questa scoperta egli sviluppò la prima immagine ai raggi X di un campione umano, quella della mano di sua moglie, mostrata in figura 3.

Sappiamo oggi che i raggi X sono luce con lunghezza d’onda minore di quella visibile, e possono attraversare inalterati la pelle e i muscoli ma non le ossa, come nell’esempio della mano. La capacità di penetrare nei campioni è un grande vantaggio rispetto alla microscopia ottica: si pensi che nell’esempio della cipolla (figura 1), già sovrapponendo circa 10 strati di pellicole di cipolla la luce viene assorbita completamente dal campione e l’immagine risulta nera.

Il limite principale dei raggi X sta nel fatto che un’esposizione prolungata causa un rapido danneggiamento del campione: uno dei primi sperimentatori dei raggi X per usi medici, John Hall-Edwards, dovette farsi amputare la mano per l’eccessivo irraggiamento subito.

Grazie alla loro ridotta lunghezza d’onda, e alla loro capacità di attraversare i tessuti, i raggi X si sono affermati non solo come strumenti per le radiografie, ma anche come mezzo per effettuare microscopia ad alta risoluzione. Difatti, come vedremo nella sezione seguente, la risoluzione di un’immagine è legata alla lunghezza d’onda utilizzata.

Le tecniche di superrisoluzione ottica mirano a essere poco invasive, come la normale microscopia ottica e a risolvere oggetti piccoli per poterli visualizzare senza dover ricorrere ad altre tecniche come i raggi X, che pur garantendo migliore risoluzione danneggiano i campioni biologici.

Figura 3 - (A) Foto di una mano: la luce visibile viene interamente assorbita dalla mano. (B) Foto della mano della moglie di Wilhelm Röntgenm, attraversata dai raggi X (Deutsches Museum München).

Figura 3 – (A) Foto di una mano: la luce visibile viene interamente assorbita dalla mano. (B) Foto della mano della moglie di Wilhelm Röntgen, attraversata dai raggi X (Deutsches Museum München).

 

2. La risoluzione e i suoi limiti

Il termine risoluzione è intuitivamente legato alla qualità di un’immagine, che sia essa una fotografia da rullino, una rappresentazione del cielo raccolta da un telescopio o il segnale che i nostri occhi mandano al cervello. Per quanto questi processi di formazione di immagini possano sembrare eterogenei, i principi fisici da cui essi dipendono sono gli stessi: gli ingredienti di base di un qualsiasi sistema ottico sono un campione (che può essere illuminato da una sorgente luminosa, o luminoso esso stesso), una lente e una superficie di proiezione.

Consideriamo un campione costituito da un singolo punto che emette luce (non importa se sia luce da esso riflessa, trasmessa od emessa). Ogni tentativo di proiettare un tale punto luminoso tramite una lente comporta una perdita di definizione. Un punto emette luce in tutte le direzioni, ma una lente non può che raccoglierne una parte (figura 4A). Questa perdita di informazione risulta in un alone attorno all’immagine del punto, che non può essere in alcun modo eliminato. In realtà ogni campione per quanto complesso può essere trattato come se fosse costituito da molti piccolissimi punti luminosi Anche qui il fatto che questi punti siano effettivamente sorgenti di luce come il pixel di uno schermo, o che trasmettano luce come gli strati di una cipolla non porta a nessuna differenza per i concetti trattati. che emettono luce in ogni direzione, come in figura 4B, e una lente sfocherà l’immagine creando un alone attorno a ogni punto. Se una fotografia ci sembra nitida o un testo ben definito è solo perché quest’alone è molto piccolo; ma se ad esempio guardiamo delle scritte piccole su una fotografia, nonostante i nostri sforzi l’immagine ci apparirà sempre sfocata, come in figura 4C.

Figura 4 - Schema del concetto di sfocamento. (A) Principio fisico della perdita di informazioni nel passaggio tramite una lente. (B) Generalizzazione per un’immagine complessa (C) Cosa succede se i punti sono molto vicini tra loro?

Figura 4 – Schema del concetto di sfocamento. (A) Principio fisico della perdita di informazioni nel passaggio tramite una lente. (B) Generalizzazione per un’immagine complessa (C) Cosa succede se i punti sono molto vicini tra loro?

 

Definizione di risoluzione
Una trattazione quantitativa di questo fenomeno è stata fatta per la prima volta dal fisico tedesco Ernst Karl Abbe nel 1873. Il criterio da egli introdotto si basa sulla capacità di distinguere due punti vicini Ma esitono punti geometrici in natura? Il problema dipende dalla scala dell’osservazione: se osservo una cellula, una proteina piccola in essa contentuta può essere considerata con ottima approssimazione un punto; se prendo una foto della terra dallo spazio, un’intera città può fare al caso nostro, mentre se sto studiando una galassia con un telescopio, le singole stelle sono sufficientemente piccole da essere considerate sorgenti puntiformi di luce!.

Se proiettiamo due punti tramite una lente e li avviciniamo tra loro, ma senza farli mai toccare, come in figura 5, arriveranno ad essere talmente vicini che la loro immagine ci apparirà come un solo punto. Come definire la distanza minima al di sotto della quale avviene questo?

Un criterio per dire che due punti sono distinti può essere per esempio il fatto che la distanza tra i centri sia maggiore della larghezza di ogni alone. Abbe scoprì che questa distanza minima dmin è legata alla lunghezza d’onda della luce (solitamente chiamata λ) emessa dal punto, secondo la relazione In realtà la distanza minima dipende da un altro parametro detto apertura numerica NA, secondo la relazione dmin = lambda/2 NA. L’apertura numerica dipende dalla lente utilizzata, e i migliori obiettivi al momento non riescono a superare un valore di 1.45, che riporta alla formula indicata.:

dmin = 0.34 λ

 

Figura 5 - Criterio di risoluzione: avvicinando due punti nel piano del campione, gli aloni che si formano nel piano immagine andranno a sovrapporsi fino a quando i due punti che erano separati nel campione non saranno più distinguibili nell’immagine.

Figura 5 – Criterio di risoluzione: avvicinando due punti nel piano del campione, gli aloni che si formano nel piano immagine andranno a sovrapporsi fino a quando i due punti che erano separati nel campione non saranno più distinguibili nell’immagine.

 

Limitandoci alla luce visibile, già illuminando un campione con luce viola (λ = 400 nm) invece che con luce rossa (λ = 650 nm) è possibile diminuire la distanza minima da circa 230 nm a circa 150 nm, e quindi aumentare la risoluzione dell’immagine.

Questa distanza minima è sufficiente a distinguere tra loro cellule od organelli di media dimensione, ma non permette di visualizzare DNA, singole proteine o piccoli agglomerati di esse, che sono dell’ordine di 1-100nm. Riprendendo quanto detto nell’introduzione, l’utilizzo di raggi X (figura 2) permette invece di discernere oggetti distanti meno di 20 nm.

Per portare un esempio concreto di come diverse tecniche di microscopia si siano evolute aiutando a rispondere a domande differenti, riportiamo alla fine dell’articolo un riquadro dedicato allo studio del muscolo (figura 6).

Fatta eccezione per gli articoli del 1986 e del 2014, tutte le tecniche presentate nel riquadro sfruttano i principi descritti fino ad ora: si illumina il muscolo con sorgenti differenti (luce visibile, raggi X, elettroni) e si guarda come esso assorba o devii il fascio di luce.

Le conoscenze necessarie per comprendere i due restanti riquadri in figura 6 saranno oggetto del prossimo articolo di questa mini-serie, in cui vedremo come le tecniche di microscopia a fluorescenza e la superrisoluzione espandono ulteriormente le possibilità di studio dei campioni biologici, tra cui il muscolo.

Figura 6 - Panoramica delle tecniche utilizzate per la visualizzazione dei componenti del muscolo.

Figura 6 – Panoramica delle tecniche utilizzate per la visualizzazione dei componenti del muscolo.

Info sui Revisori di questo articolo

Giorgia Palano è PhD student in Cardiovascular Regenerative Medicine al Karolinska Institutet (SE).

Matteo Campioni, PhD in biologia molecolare e biochimica presso l’Università di Ferrara, è attualmente ricercatore post-dottorato presso il Laboratorio Armenise-Harvard di Biologia Strutturale, Università di Pavia (IT).

Maria Rossana Caniglia è Architetto e PhD in Conservazione dei Beni Architettonici e Ambientali.

About the Author

Leone Rossetti
Leone Rossetti
Leone Rossetti è nato a Milano nel 1988. Dopo essersi laureato in Fisica alla Università degli Studi di Milano si è specializzato in Biofisica. Ha conseguito la laurea specialistica all'Università di Milano-Bicocca, lavorando nel gruppo di Biofisica e Biofotonica, dove ha svolto una ricerca sull'interazione tra le nanoparticelle metalliche e le cellule. Dal 2012 vive a Monaco di Baviera, dove è dottorando nel gruppo di Biofisica della Cellula presso la Technische Universitaet Muenchen. Il suo lavoro di ricerca è incentrato sulle applicazioni della microscopia allo studio delle proprietà micromeccaniche dei tessuti biologici.

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